吴 晶 李井干 凌 键 陈云芳 单鲁月 伏建国

吴 晶 ¹ 李井干 ¹ 凌 键 ² 陈云芳 ³ 单鲁月 ⁴ 伏 建国 ^{1 *}

摘 要 为建立精准、高效的不实雀麦地理溯源技术，本研究收集了法国、乌克兰、丹麦及我国监测点的共计 32 株不实雀麦样本，采用重测序并结合机器学习方法，开发地理特异性 InDel 分子标记。结果表明，基于全基因组重测序分析，在不实雀麦基因组中鉴定出 27484586 个 SNP位点及 2879407 个InDel位点。进一步采用随机森林的机器学习方法，从中筛选出具有地理来源特异性的 InDel 位点，这些位点可精准区分法国、乌克兰、丹麦不同地理来源的不实雀麦样本。另外，利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术对这些地理特异性 InDel 位点进行了实验验证，序列比对结果表明这些特异性目标InDel片段在不同地理种群有明显差异，能准确判别不同地理种群，并据此建立了基于目标InDel分子标记的溯源方法。本研究为不实雀麦的口岸检疫溯源、入侵路径追踪及科学防控提供了关键技术支撑，也为其他外来入侵杂草的地理溯源分子标记开发提供了参考。

关键词 不实雀麦；基因组重测序；InDel标记；溯源分析

Development of Rapid Traceability InDel Markers for Bromus sterilis L. Based on Whole-Genome Resequencing

WU Jing ¹ LI Jing-Gan ¹ LING Jian ² CHEN Yun-Fang ³ SHAN Lu-Yue ⁴ FU Jian-Guo ^1*

Abstract To establish a precise and efficient geographic traceability system for Bromus sterilis L. (sterile brome), 32 samples were collected from three countries (France, Ukraine, and Denmark) and domestic monitoring sites in China in this study. Using whole-genome resequencing combined with machine learning, we developed geographically specific InDel molecular markers. The results showed that a total of 27,484,586 single nucleotide polymorphism (SNP) loci and 2,879,407 insertion-deletion (InDel) loci were identified in the genome of Bromus sterilis L. via whole-genome resequencing analysis. Furthermore, a random forest-based machine learning approach was employed to screen InDel loci with geographic origin specificity, which could accurately distinguish samples from France, Ukraine, and Denmark. These geographically specific InDel loci were experimentally validated using polymerase chain reaction (PCR) technology. Sequence alignment results revealed significant differences in these specific target InDel fragments among different geographic populations, enabling accurate discrimination of distinct geographic populations. Consequently, a traceability method based on these target InDel molecular markers was established. This study provides crucial technical support for port quarantine traceability, invasion pathway tracking, and scientific prevention and control of Bromus sterilis L., and also serves as a reference for developing geographic traceability molecular markers for other invasive alien weeds.

Keywords Bromus sterilis L.; whole-genome resequencing; InDel markers; traceability analysis

基金项目：国家重点研发计划项目（2023YFC2604901）

第一作者：吴晶（1981—），女，汉族，云南昆明人，硕士，高级农艺师，主要从事进境杂草检疫鉴定等相关工作，E-mail: 16007855@qq.com

通信作者：伏建国（1981—），男，汉族，江苏徐州人，硕士，正高级农艺师，主要从事进境植物检验检疫、杂草检疫鉴定等相关工作，E-mail: 372567981@qq.com

1. 南京海关动植物与食品检测中心 南京 210037

2. 中国农业研究院蔬菜花卉研究所 北京 100081

3. 苏州海关综合技术中心 苏州 215100

4. 南京农业大学生命科学学院 南京 210095

1. Nanjing Customs Animal, Plant and Food Testing Center, Nanjing 210037

2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

3. Suzhou Customs Comprehensive Technical Center, Suzhou 215100

4. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

不实雀麦为禾本科雀麦属窄穗组植物，原产于欧洲、地中海地区及中亚，现已扩散至非洲北部、澳大利亚、美洲等多个国家和地区，是全球公认的恶性入侵杂草 ^[1]。该杂草具有极强的生态适应性和繁殖能力，不仅与农作物争夺光照、水分和养分，还会降低作物产量与品质，受其危害的作物包括小麦、大麦、甜菜、向日葵等多种重要农作物 ^[2]。由于不实雀麦小花在作物收获时易混入种子、饲料等，成为国际贸易中远距离传播的主要入侵途径，我国已在口岸多次截获该物种^[3]。目前，不实雀麦已被列为芬兰、丹麦等国家输华植物检疫重点关注的有害生物，同时被墨西哥、秘鲁等国家纳入限定性有害生物名录，其溯源防控已成为保障农业生态安全的重要任务 ^[4]。

现有外来入侵物种溯源方法多依赖形态学鉴定和常规分子标记技术，但形态学鉴定易受环境因素影响，且近缘种鉴别难度大；传统上序列重复SSR和SNP标记在基因分型和多样性分析中被广泛应用。但在口岸快速检疫和溯源的需求背景下，这些传统标记面临特异性不足和溯源精度有限的挑战^[5-6]。基于全基因组重测序开发的插入缺失标记技术（Insertion-deletion，InDel）分子标记，具有操作简便、成本低廉、稳定性强、多态性显著等优势，已在动植物遗传学研究、物种鉴定、农作物育种、物种溯源、水生动物地理型溯源等领域得到成功应用 ^[7-11]。在植物物种研究中，InDel分子标记已成为植物遗传学研究和分子育种中不可或缺的工具。Fang Q 等^[12]通过比较4种柑橘属植物的全基因组序列，开发了大量的物种特异性InDel标记，能够区分不同的柑橘属物种还能用于种内分析。Yuan H 等^[13]通过 InDel标记有效表征水稻亚种，并用于基因作图、遗传多样性分析和分子标记辅助育种。Warsadiharja S M 等^[14]通过比较野生番茄和栽培番茄的全基因组重测序数据，开发全基因组InDel变异，成功用于番茄突变体的遗传作图，加速了与表型相关突变基因的识别。这些研究表明，结合基因组重测序技术可挖掘物种特异性 InDel 位点，能够实现入侵物种地理来源的精准判别。

针对不实雀麦现有溯源技术的局限性，本研究通过多平台联合测序解析其全基因组特征，大规模挖掘不同地理来源的特异性 InDel 位点，开发高效、精准的溯源分子标记及检测方法，为不实雀麦的口岸检疫、入侵路径追踪及科学防控提供技术支撑，同时为其他外来入侵杂草的溯源研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源

不实雀麦样本共计32 株，其中地理来源为法国的18 株、乌克兰的11 株、丹麦的2株以及1 株为来源于我国监测点的样本。所有样本以种子形式保存，播种于无菌培养钵中，置于人工气候箱内，温度 25℃、光照 16 h / 黑暗 8 h进行培养，待幼苗长至3～4 叶期时，采集地上部分新鲜组织用于 DNA 提取。

1.2 方法

1.2.1 基因组 DNA 提取与质检

取0.5 g新鲜植物组织，液氮速冻后研磨成粉末，按照植物组织基因组DNA核酸提取试剂盒（西安天隆科技有限公司）说明书提取基因组 DNA。通过0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性，Qubit 4.0 生物分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）测定 DNA 浓度，合格样本置于-80℃保存备用。

1.2.2 样品的重测序及SNP、 InDel位点鉴定

32个样品由武汉贝纳科技有限公司进行建库和测序。采用Plus DNA Library Prep Kit对基因组DNA进行建库，构建得到文库，并使用DNBSEQ平台完成测序。测序的数据利用Fastp软件进行质量过滤和修剪，去除低质量序列（Q值＜20）和接头序列，保留高质量的测序数据用于后续分析。

选择已发表的不实雀麦染色体水平的基因（GCA_950022295.1）作为参考基因组，将32个重测序样本的有效读段通过 BWA-MEM 算法比对到参考基因组，经 Picard 软件去重、利用GATK（V4.1.6.0）的HaplotypeCaller、VariantFiltration、CombineGVCFs等命令获得vcf文件，过滤的标准为：QD＜2.0，FS＞60.0，MQ＜20.0。进一步使用vcftools（V0.1.16）对合并的vcf文件进行过滤，运行参数为：--maf 0.05，--minQ 30，--min DP4，--maxDP 1000。

1.2.3 机器学习鉴定具有不同来源特征的InDel

利用上述生成的InDel数据对不同国家来源样本进行了基于机器学习的特征分析，以此鉴定能够代表不同国家来源的InDel数据。使用Python的Sklearn模块中随机森林分类器（Random Forest Classifier）模块进行分类判别与代表性位点筛选。输入为样本InDel的二元基因型矩阵，分类任务采用One-vs-Rest策略；模型以基尼重要性排序并设定阈值，保留前100个InDel 作为候选标记。鉴定出具有重要分类性状的InDel位点，通过人工比较，最后确认可以用于对外来入侵物种进行溯源的InDel位点。

1.2.4 目标 InDel 特异性标记筛选与引物设计

针对法国、乌克兰、丹麦3个地区来源样本，筛选仅在单一地区样本中稳定存在、其他地区样本中无扩增的 InDel 位点。使用 Primer 5.0 软件设计引物，引物设计原则为：退火温度 55～65℃，产物长度100～200 bp，避免发夹结构和二聚体。通过Blast在线工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）验证引物特异性，引物由生工生物工程（南京）股份有限公司合成。

1.2.5 InDel分子标记方法的验证

以9份不同地理来源的不实雀麦基因组DNA 为模板，利用1.2.4中筛选出的不同地理种群的目标 InDel 的引物进行PCR扩增。配置反应体系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，10 μmol/L 正向引物 0.5 μL，10 μmol/L 反向引物0.5 μL，模板 DNA 1 μL，ddH₂O 补至 20 μL。扩增程序：95℃预变性 5 min；95℃变性15 s，52～60℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，循环 35 次；72℃延伸 5 min。PCR扩增产物送至生工生物工程（南京）股份有限公司进行测序。

2 结果与分析

对32个样本进行重测序分析，共获得了703 GB的Clean Data数据，平均每个样本的数据量为21.30 GB，测序深度介于 7.36 ×～9.70 ×之间，平均覆盖基因组8.50 ×，将32个样本的重测序数据比对到参考基因组上，样本的平均比对率达到了 99.67%（表1）。基因组的覆盖率介于90.84%～96.25%之间，平均覆盖率达到了94.09%。最后，通过 GATK 等软件检测及过滤，最终在不实雀麦的基因组中鉴定了27484586个SNP位点，以及2879407个InDel位点。不实雀麦的基因组中，平均每1 kb有10.57个 SNP 和 1.11 个InDel位点。

2.1 基于机器学习的不实雀麦的溯源分析

在本实验中，使用 InDel 位点作为机器学习鉴定不同地理来源样本特异变异位点的分析数据。以机器学习中的随机森林算法作为分类器，根据特征值的重要性进行排序，获得了多个代表性位点，这些位点分布于多条染色体，兼具基因间区与低复杂度区域特征。例如：4号染色体上的位点220991442，只在来源于丹麦的样品中出现1个删除的突变（TTGATCAACG –>T），来源于法国和乌克兰的样本未检测出该突变。6号染色体chr3上的位点 9066246，只在来源于法国的样本有检测出突变（T–>TC）；1号染色体的383399701位点，只在来源于乌克兰的样品中检测出突变（A–>AATC）。进一步提取这些变异位点上下游200 bp的序列进行系统演化树的构建，结果均可见具有这些特异变异位点的样本与其他地理来源样本能够明显地进行区分，具体如图1、图2、图3所示。

图1 不实雀麦法国种群样本溯源模型聚类图

Fig.1 Clustering plot of the traceability model for Bromus sterilis L. samples from French populations

2.2 不同地理特异性 InDel 标记筛选和引物设计

全基因组重测序鉴定的InDel 位点长度分布以 10～50 bp 为主，符合地理特异性标记筛选的长度要求。通过对比不同地理来源样本的 InDel 位点分布，筛选出 12 个具有地理特异性的 InDel 位点，其中法国特有位点 4 个、乌克兰特有位点 5 个、丹麦特有位点 3 个。这些位点在目标地理来源样本中的检出率为 100%，在其他地理来源样本中无扩增产物，表现出极强的地理特异性。基于测序数据，筛选出3对InDel分子标记引物对用于不实雀麦中法国、丹麦、乌克兰3个不同地理型的鉴别。所有引物对的核苷酸序列见表 2。

2.3 InDel分子标记对不实雀麦不同地理型的判别结果

使用 DNASTAR Lasergene 软件包中的Seqman程序对测序获得序列进行组装和校对，去除低质量区和引物区，获得9份样品3个地理种群目标InDel 片段的DNA序列。再运用 BioEdit 软件对目标条形码序列进行序列分析，能够准确地区分出不实雀麦不同来源地理型（图4、图5、图6），验证了InDel分子标记对不实雀麦不同地理型判别的实用性和稳定性。基于上述验证结论，进一步构建了适用于不实雀麦不同地理种群的 InDel 分子检测验证方法。

3 讨论与结论

传统溯源方法主要依赖形态学鉴定和常规SSR、SNP分子标记技术，虽有一定应用基础，但存在局限性。其中，形态学鉴定易受环境与发育阶段影响，且近缘种区分困难；常规分子标记在通用性上具有优势，但在特异性与溯源分辨力方面仍显不足。InDel 标记引物设计相对简便、检测较为容易，是全基因组分子标记开发的理想来源^[5-6,15-17]。

相比之下，本研究基于全基因组重测序结合机器学习方法，开发地理特异性InDel标记，构建了高效、精准的溯源技术。基于随机森林等机器学习算法，能够从全基因组层面挖掘具有群体区分能力的InDel位点，并结合系统发育分析实现可视化判别，为入侵路径推断与来源判定提供可靠分子依据；筛选出的3个地理特异性InDel标记，在目标地理来源样本中检出率为100%，且在其他地区无交叉扩增，有效避免了假阳性问题。这些标记直接源于基因组水平的地理群体特异变异标记，特异性强、分辨率高；所开发的InDel标记可通过常规PCR扩增与测序验证，流程简单、设备要求低，易于在口岸实验室推广使用。

与以往多数研究采用电泳图呈现InDel标记片段大小多态性的方式不同，本研究进一步对目标InDel片段进行测序，并通过DNA序列比对方式直观呈现不同地理种群间的序列差异，避免因电泳条带模糊、片段大小相近或非特异性扩增带来的误判，通过序列比对可直接确认插入、缺失的具体序列及其位置，提高溯源判断的可靠性。序列比对不仅能确认InDel是否存在，还可分析侧翼序列保守性，为探讨变异来源与演化关系提供线索。获得的序列信息可存入数据库，便于后续比对、复核及溯源网络的构建，为长期监测与跨境溯源提供标准化分子数据支撑。

目前研究样本主要来源于法国、乌克兰、丹麦及我国个别监测点，尚未覆盖不实雀麦的其他分布区。因此，本研究所开发标记的全球适用性仍需进一步验证。后续研究将扩大样本收集范围，挖掘更多地理特异性位点，逐步构建覆盖全球主要入侵源的溯源标记体系。此外，这些 InDel 标记可进一步开发为荧光 PCR 试剂盒，显著提升口岸溯源检测效率，为不实雀麦的检疫监管和入侵路径追溯提供关键技术支撑，并为其他入侵性害虫的溯源研究提供方法论参考。

综上所述，本研究基于全基因组重测序与机器学习技术，开发了不实雀麦地理特异性InDel分子标记，并结合DNA序列比对方式实现精准判别，建立了快速、准确、稳定的溯源检测方法，不仅为不实雀麦的口岸检疫、入侵路径追踪与综合治理提供了关键技术工具，也为其他外来入侵物种的分子溯源研究提供了可借鉴的技术路径与操作模式。

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表1 不同地理来源的不实雀麦样品重测序数据

Table 1 Resequencing data of Bromus sterilis L. samples from different geographical origins

图2 不实雀麦乌克兰种群样本溯源模型聚类图

Fig.2 Clustering plot of the traceability model for Bromus sterilis L. samples from Ukrainian populations

图3 不实雀麦丹麦种群样本溯源模型聚类图

Fig.3 Clustering plot of the traceability model for Bromus sterilis L. samples from Danish populations

表2 所用引物序列及相应PCR反应条件

Table 2 Primer sequences and corresponding PCR conditions

图4 不实雀麦法国种群特异性 InDel 片段的DNA序列比对

Fig.4 DNA sequence alignment of France population-specific InDel fragments of Bromus sterilis L.

图5 不实雀麦乌克兰种群特异性 InDel 片段的DNA序列比对

Fig.5 DNA sequence alignment of Ukraine population-specific InDel fragments of Bromus sterilis L.

图6 不实雀麦丹麦种群特异性 InDel 片段的DNA序列比对

Fig.6 DNA sequence alignment of Denmark population-specific InDel fragments of Bromus arvensis L.